T7 RNA聚合酶筛选 (高通量)
客户需求:交付一步纯化的突变体
客户要求 | 样品数量 | 交付周期 | 表达规模 | 质控检测 | ||
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交付一步纯化的突变体 | 76个 | 22个工作日 | 50 mL | A280 | SDS-PAGE | 完整分子量 (随机挑选5个) |
76个RNA聚合酶表达数据统计
1. 候选酶筛选(高通量表达)
表达体积:4-50mL
表达产能:700个样品/周
评估蛋白表达水平和溶解度
可以在未经纯化的样品或低纯度样品中进行酶活性测试
2. 候选酶筛选(小规模表达)
表达体积:1L (烧瓶) 或5L (发酵罐)
表达产能:200个样品/周
纯化后的产量和质量数据
检测杂质是否会影响测试
小规模表达再次确认候选物
3. 细胞库构建
载体和菌株筛选,以及密码子优化
WCB 10-50代传代稳定性测试:质粒丢失率&表达水平
利用 (DLA) 技术对主细胞库和工作细胞库的噬菌体进行检测
周期性测试工作细胞库的活力和表达水平,以确定保存时间
4. 上游工艺开发
表达量:20-500L(发酵罐)
发酵工艺:高密度
细胞密度 (OD 600) > 200
5. 下游工艺开发
His标签蛋白或无标签蛋白; 纯度 (HPLC): 高至99%
内毒素水平: <1EU /mg; 产量:高至15 g/L)
6. 分析方法开发
7. 制剂开发
候选缓冲液的性能将在应力条件下进行测试,并在某些点检查纯度或活性
8. 稳定性评估
两种压力条件,一个月内检查纯度或活性4次
两个加速条件,6个月内检查纯度或活性3次
在储存条件下,24个月内检查纯度或活性9次
发货状况确认
9. 放大生产
T7 RNA聚合酶筛选 (高通量)
客户需求:交付一步纯化的突变体
客户要求 | 样品数量 | 交付周期 | 表达规模 | 质控检测 | ||
---|---|---|---|---|---|---|
交付一步纯化的突变体 | 76个 | 22个工作日 | 50 mL | A280 | SDS-PAGE | 完整分子量 (随机挑选5个) |
76个RNA聚合酶表达数据统计
T7 RNA聚合酶筛选 (1L表达规模)
客户需求:90%纯度, 交付量5mg, 去除核酸&核酸酶
用于基因编辑的X酶
项目目的:交付该基因编辑X酶的工作细胞库
备注:选择表达量突出的克隆构建MCB和WCB
1. 表达量评估 & 限制性酶切图谱
结果:通过质粒表达水平评估和限制性检查确认MCB和WCB
2. 噬菌体检测
利用 (DLA) 技术对主细胞库和工作细胞库的噬菌体进行检测
结果:主细胞库和工作细胞库中没有噬菌体污染。
3. 质粒稳定性测试
抗生素加压WCB细胞传代培养 (P20)
结果:工作细胞库的表达水平保持稳定,P1、P5、P10、P15 和 P20 代的SDS-PAGE结果没有显著降低。
无抗生素加压WCB细胞传代培养 (P20)
结果:工作细胞库(P1、P5和P10)传代中无明显质粒丢失。
4. 长期细胞库活力测试
测试工作细胞库的活力和表达水平以确定细胞库储存时间。
检测项 | 存储时间检查点 (月) | |||||
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0 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
细胞活力 | 通过 | 通过 | 进行中 | 进行中 | 进行中 | 进行中 |
表达水平 | 通过 | 通过 | 进行中 | 进行中 | 进行中 | 进行中 |
用于基因编辑的X酶
项目目的:对该基因编辑酶的细胞培养和纯化工艺进行优化
阶段 | 项目 | 批次 1 |
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上游工艺开发 (细胞培养) | 细胞密度 (OD 600) | 102 |
湿菌重量 | 234 g/L | |
培养时间 | 22 h | |
下游工艺开发 (纯化) | 外观 | 澄清, 无色, 液体 |
浓度 | 12.45 mg/ml | |
纯度 (SDS-PAGE) | >90% | |
纯度 (RP-HPLC) | >95% | |
纯度 (SEC-HPLC) | >95% | |
内毒素 | 1.7 EU/mg | |
宿主细胞残留 (HCP) | 35.49 ng/mL | |
宿主DNA残留 (HCD) | 0.06 ng/mL | |
Residual DNAse |
|
|
支原体检测 | 阴性 | |
产量 | 29.2 mg/L |
用于体外诊断的X酶
项目目的:对该体外诊断酶的细胞培养和纯化工艺进行优化
阶段 | 项目 | 批次 1 |
---|---|---|
上游工艺开发 (细胞培养) | 细胞密度 (OD 600) | 162 |
湿菌重量 | 250 g/L | |
培养时间 | 22 h | |
下游工艺开发 (纯化) | 外观 | 黄色粉末 |
浓度 | 50 mg/ml | |
纯度 (SDS-PAGE) | >95% | |
纯度 (SEC-HPLC) | >99% | |
水分 | 4.0 % | |
活性 | > 40 KU/g | |
产量 | > 4.5 g/L |
SDS-PAGE
SEC/RP-HPLC
E.coli 宿主DNA残留检测
qPCR assay kit
支原体DNA检测
qPCR assay kit
内毒素检测
Endotoxin LAL test
E.coli 宿主细胞残留检测
ELISA assay kit
脱氧核糖核酸酶残留检测
DNaseAlert™ QC System
核糖核酸酶残留检测
RNaseAlert™ QC System
MAD7酶活性方法
缓冲液1 | 缓冲液2 | |
---|---|---|
sgRNA1 | 82.3% | 91.3% |
sgRNA2 | 62.6% | 87.9% |
sgRNA3 | 84.3% | 93.3% |
sgRNA4 | 42.7% | 66.8% |
sgRNA5 | 68.8% | 93.0% |
sgRNA | 酶 | 10分钟 | 60分钟 |
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sgRNA3(30nM) | MAD7(5 nM) | 84.3% | 90.1% |
sgRNA3(30nM) | MAD7(15 nM) | 93.1% | 98.2% |
sgRNA3(30nM) | MAD7(30 nM) | 97.9% | 98.4% |
MAD7存储缓冲液筛选
简称 | 编号 | 缓冲液组成 | 来源 |
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P | Buffer 1 | 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5, 50 % (v/v) glycerol and 1 mM TCEP | Rojek et al., 2021 |
TA | Buffer 2 | 10 mM Tris (pH 7.4), 300 mM NaCl, 1 mM TCEP, and 50% (v/v) glycerol. | GenScript |
TB | Buffer 3 | 10 mM Tris (pH 7.4), 300 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0.1 mM EDTA, and 50% Glycerol | ABM |
MAD7的冻融检测
起始材料 | -80°C 轻度冻融 (10次) | LN2快速冻融 (10次) | |
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外观 | 透明液体 | 透明液体 | 透明液体 |
HPLC 纯度 | >99% | >99% | >99% |
A280 浓度 (mg/ml) | 11.40 | 11.55 | 10.76 |
SDS-PAGE 纯度 | 90% | 90% | 90% |
MAD7压力稳定性检测
0 天 | 5 天 | 10 天 | 30 天 | |
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外观 (15°C) | 澄清 | 澄清 | 澄清 | 澄清 |
纯度 (15°C) | 99% | 99% | 99% | 99% |
外观 (37°C) | 澄清 | 发白 | 发白 | 发白 |
纯度 (37°C) | 99% | 91% | 85% | 71% |
MAD7加速稳定性检测
0 月 | 3 月 | 6 月 | |
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外观 (5°C) | 澄清 | 进行中 | 进行中 |
纯度 (5°C) | 99% | 进行中 | 进行中 |
外观 (25°C) | 澄清 | 进行中 | 进行中 |
纯度 (25°C) | 99% | 进行中 | 进行中 |
MAD7长期稳定性检测
0 月 | 1 月 | 2 月 | 3 月 | 6 月 | 9 月 | 12 月 | 18 月 | 24 月 | |
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外观 | 澄清 | 澄清 | 澄清 | 进行中 | 进行中 | 进行中 | 进行中 | 进行中 | 进行中 |
A280 浓度 (mg/ml) | 11.40 | 11.36 | 11.11 | 进行中 | 进行中 | 进行中 | 进行中 | 进行中 | 进行中 |
HPLC 纯度 | >99% | >99% | >99% | 进行中 | 进行中 | 进行中 | 进行中 | 进行中 | 进行中 |
问:定制化酶的开发和交付的常规交付周期是多久?
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